La somministrazione di NAD+ riduce in modo marcato il danno cutaneo da UVC attenuando stress ossidativo, infiammazione, danno al DNA e apoptosi

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Mengmeng Li1, Mingchao Zhang1,2, Yin Zhang3, Yu Liang3, Weihai Ying1

1Med-X Research Institute and School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, P. R. China; 2Multiscale Research Institute of Complex Systems, Fudan University, Shanghai 200433, P. R. China; 3Department of Orthopedics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 197 Ruijin 2nd Road, Shanghai 200025, P. R. China

Ricevuto il 6 marzo 2023; accettato il 4 aprile 2023; Epub 15 aprile 2023; pubblicato il 30 aprile 2023

Abstract: le radiazioni ultraviolette (UV) sono una delle principali cause di numerose malattie della pelle, compreso il tumore cutaneo. È fondamentale individuare nuovi agenti capaci di esercitare un'azione protettiva marcata sul danno cutaneo prodotto dagli UV. In questo studio, su un modello murino, abbiamo determinato gli effetti del NAD+ sul danno cutaneo indotto da UVC e abbiamo indagato i meccanismi alla base di tali effetti, con i risultati seguenti. Primo: l'autofluorescenza verde (AF) della pelle indotta da UVC era fortemente correlata all'entità del danno cutaneo indotto da UVC; secondo: la somministrazione di NAD+ ha ridotto in modo marcato il danno cutaneo indotto da UVC; terzo: la somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo le riduzioni, indotte da UVC, dei livelli di superossido dismutasi mitocondriale e catalasi; quarto: la somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo l'aumento, indotto da UVC, del livello di cicloossigenasi (COX) 2, un marcatore di infiammazione; quinto: la somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo marcato l'aumento, indotto da UVC, del danno al DNA a doppio filamento (dsDNA); e sesto: la somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo marcato le riduzioni, indotte da UVC, del rapporto Bcl-2/Bax, un indice di apoptosi. Nel complesso, il nostro studio ha rilevato che la somministrazione di NAD+ può ridurre in modo marcato il danno cutaneo indotto da UVC attenuando lo stress ossidativo, l'infiammazione, il danno al DNA e l'apoptosi, il che suggerisce un potenziale interesse del NAD+ come agente protettivo nei confronti del danno cutaneo indotto da UVC in questo modello sperimentale. Inoltre, il nostro studio indica che l'AF verde della pelle è un biomarcatore utile a predire il danno cutaneo indotto da UVC.

Parole chiave: NAD+, UV, danno cutaneo, apoptosi, autofluorescenza verde

Introduzione

Il NAD+ svolge un ruolo cruciale in numerosi processi biologici di primo piano, tra cui il metabolismo energetico, la funzione mitocondriale, la morte cellulare, la riparazione del DNA e le funzioni immunitarie [1, 2]. Un numero crescente di evidenze indica che il NAD+ può produrre effetti benefici significativi in diversi modelli animali di malattia, tra cui il danno cerebrale ischemico e il danno miocardico ischemico [3-5]. È opportuno determinare ulteriormente gli effetti del NAD+ in vari modelli di malattia e approfondire i meccanismi alla base degli effetti del NAD+ sul danno a tessuti e organi [3].

L'irraggiamento UV è una causa determinante di numerose malattie della pelle, compreso il tumore cutaneo [6-8]. L'irraggiamento UV può produrre molteplici alterazioni patologiche della pelle, tra cui il fotoinvecchiamento e il tumore cutaneo [8, 9], che derivano dalla sua capacità di indurre nella cute modificazioni quali stress ossidativo, infiammazione, danno al DNA e apoptosi [10, 11]. Sebbene diversi studi abbiano individuato agenti protettivi per la pelle [12, 13], resta molto rilevante scoprire nuovi agenti in grado di offrire una protezione marcata dal danno cutaneo indotto dagli UV.

Esistono tre tipi principali di radiazione UV: UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) e UVC (100-280 nm) [8]. A causa del progressivo assottigliamento dello strato di ozono atmosferico, la radiazione UVC che raggiunge la superficie terrestre è aumentata e rappresenta una preoccupazione ambientale sempre più rilevante [14]. Essendo una radiazione ionizzante, l'UVC è un potente mutageno in grado di causare tumori e malattie immunomediate [14]. La maggior parte degli studi sugli agenti protettivi dalle radiazioni UV si è concentrata su quelli che proteggono dal danno cutaneo indotto da UVB o UVA [12, 13]. È quindi molto utile cercare agenti capaci di ridurre in modo marcato il danno cutaneo indotto da UVC.

È importante individuare biomarcatori per la previsione non invasiva del danno cutaneo indotto dagli UV, perché possono aumentare in misura significativa la nostra capacità di diagnosi precoce e di intervento sul danno cutaneo indotto dagli UV [15]. Un nostro studio recente ha indicato che l'intensità dell'AF verde della pelle è un biomarcatore utile a predire il danno cutaneo indotto da UVB/UVC [15]. È però opportuno raccogliere ulteriori evidenze a sostegno e a consolidamento di questo risultato, così da affermare questo nuovo approccio nella diagnosi precoce e nell'intervento sul danno cutaneo indotto dagli UV.

Nel presente studio ci siamo concentrati sulla determinazione degli effetti del NAD+ sul danno cutaneo indotto da UVC nei topi e abbiamo indagato i meccanismi alla base di tali effetti. Abbiamo inoltre verificato ulteriormente la validità della previsione del danno cutaneo indotto da UVC basata sull'AF verde. Il nostro studio indica che la somministrazione di NAD+ può ridurre in modo marcato il danno cutaneo indotto da UVC attenuando lo stress ossidativo, l'infiammazione, il danno al DNA e l'apoptosi. Lo studio ha inoltre fornito ulteriori evidenze a sostegno della validità del metodo basato sull'AF verde nella previsione del danno cutaneo indotto da UVC.

Materiali e metodi

Materiali

Formalina, ematossilina, eosina e NAD+ sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Gli anticorpi anti-SOD2 e anti-actina provengono da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). L'anticorpo anti-γ-H2AX è stato acquistato da Abcam (Cambridge, Regno Unito). Gli anticorpi anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-catalasi e anti-COX2 provengono da Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Tutti gli altri reagenti erano del grado più elevato disponibile in commercio.

Preparazione delle soluzioni di NAD+

Il veicolo è stato preparato mescolando volumi uguali di PBS e glicerolo. Una soluzione madre di NAD+ alla concentrazione finale di 10 mg/ml è stata ottenuta aggiungendo NAD+ al veicolo. Il NAD+ alla dose di 1 mg/cm2 è stato somministrato a ciascun orecchio.

Esperimenti sugli animali

Topi maschi C57BL/6 di 6-8 settimane di età e di peso compreso tra 18 e 22 g (Lingchang Biotechnology Co., LTD., Shanghai) sono stati mantenuti in uno stabulario SPF a temperatura e umidità controllate. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo il protocollo approvato dal Comitato di Bioetica della School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University. Dopo una settimana di osservazione, i topi sono stati irraggiati con UVC alle dosi di 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2. Da 18 a 24 ore dopo l'irraggiamento, l'AF verde delle orecchie è stata determinata con un microscopio a due fotoni (Nikon, Shanghai, Cina). Tre giorni dopo l'irraggiamento le orecchie sono state prelevate e conservate a -80 °C.

Imaging dell'AF verde della pelle: l'imaging dell'AF verde della pelle è stato eseguito come descritto in precedenza [15]. L'AF cutanea delle orecchie dei topi è stata acquisita con un microscopio a fluorescenza (A1 plus, Nikon Instech Co., Ltd., Tokyo, Giappone) in modalità a singolo fotone, con lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm ed emissione tra 500 e 530 nm. L'AF è stata quantificata secondo il seguente approccio: sulle immagini acquisite sono stati selezionati a caso sedici punti di 100 μm × 100 μm. È stata calcolata l'intensità media di AF di ciascuno strato e quindi la somma delle intensità medie di tutti gli strati di ciascun punto, valore definito come intensità di AF del singolo punto.

Analisi istologiche: le analisi istologiche sono state eseguite come descritto in precedenza [15]. Sono state prelevate biopsie cutanee dalle orecchie dei topi, poste immediatamente in tampone di paraformaldeide al 4% (p/v). Dopo 12-24 ore i campioni sono stati sottoposti alle procedure di inclusione in paraffina. La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) è stata eseguita secondo il protocollo del produttore (C0105, Beyotime, Haimen, Cina).

Colorazione in immunofluorescenza: le sezioni in paraffina sono state sparaffinate e quindi incubate con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 10 minuti.

Figura 1. L'UVC ha indotto un danno dose-dipendente alla pelle dei topi. A, B. L'irraggiamento con UVC a 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2 ha prodotto un danno dose-dipendente alla pelle dei topi. C. Le dosi di irraggiamento erano fortemente correlate ai livelli di danno cutaneo. I topi sono stati esposti a irraggiamento UVC alle dosi di 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2. Tre giorni dopo l'irraggiamento il danno cutaneo è stato determinato mediante colorazione H&E. N = 3. *, P < 0,05; **, P < 0,01. Barra di scala = 100 μm.

Dopo i lavaggi in PBS, le sezioni sono state bloccate con siero di capra al 10% per 1 ora a temperatura ambiente e quindi incubate con l'anticorpo anti-γ-H2AX (ab81299, Cell Signaling Technology, MA, USA) (diluizione 1:250) in PBS contenente 1% di siero di capra, tutta la notte a 4 °C. Dopo tre lavaggi in PBS, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo secondario Alexa Fluor® 647 di capra anti-coniglio IgG (H+L) (diluizione 1:500, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) in PBS contenente 1% di siero di capra per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi in PBS, le sezioni sono state controcolorate con DAPI (diluizione 1:1000, Beyotime Institute of Biotechnology) in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite con un microscopio confocale Leica (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania).

Western blotting

La cute auricolare dei topi è stata prelevata e lisata in tampone RIPA (Millipore, Temecula, California, USA) contenente 1% di cocktail di inibitori delle proteasi, 1% di cocktail di inibitori delle fosfatasi (CWBio, Pechino, Cina) e 1 mM di fenilmetilsolfonilfluoruro. I lisati sono stati centrifugati a 12000 rpm per 20 minuti a 4 °C. Dopo la quantificazione dei campioni proteici con il BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, USA), 30 μg di proteine totali sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato al 10% e quindi trasferiti su membrane di nitrocellulosa da 0,45 μm. Le membrane sono state incubate tutta la notte a 4 °C con gli anticorpi primari alle seguenti diluizioni: anti-COX2 (Cat#12-282, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (diluizione 1:1000), anti-SOD2 (sc-133134, Santa Cruz, California, USA) (diluizione 1:2000), anti-catalasi (Cat#14097, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (diluizione 1:2000), anti-Bcl-2 (Cat#3498, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (diluizione 1:2000), anti-Bax (Cat#5023, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (diluizione 1:2000), anti-γ-H2AX (ab81299, Abcam, Cambridge, Regno Unito) (diluizione 1:4000) e anti-actina (sc-58673, Santa Cruz, California, USA) (diluizione 1:1000). Le membrane sono state poi incubate con IgG (H+L) di capra anti-coniglio coniugate a HRP (diluizione 1:4000) (Jackson ImmunoResearch, PA, USA) oppure con IgG di capra anti-topo coniugate a HRP (diluizione 1:4000, HA1006, HuaBio, provincia dello Zhejiang, Cina). I segnali proteici sono stati rilevati con un sistema di rilevazione ECL (Thermo Scientific, Pierce, IL, USA). Le intensità delle bande sono state quantificate per densitometria con Image J.

Analisi statistica

I risultati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). L'analisi statistica è stata condotta con un'analisi della varianza a due vie seguita dal test di Bonferroni post hoc. Valori di P inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Figura 2. L'UVC ha indotto aumenti dose-dipendenti dell'intensità dell'AF verde della pelle dei topi. A, B. L'irraggiamento con UVC a 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2 ha prodotto aumenti significativi e dose-dipendenti dell'AF verde della pelle dei topi. C. Le dosi di irraggiamento erano fortemente correlate ai livelli di intensità dell'AF verde. D. Si è osservata una forte correlazione tra i livelli di intensità dell'AF verde e i livelli di danno cutaneo. I topi sono stati esposti a irraggiamento UVC alle dosi di 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2. Da 18 a 24 ore dopo l'irraggiamento, l'AF verde della pelle è stata determinata con un microscopio confocale. N = 9. *, P < 0,05; ***, P < 0,001. Barra di scala = 20 μm.

Risultati

La somministrazione di NAD+ ha ridotto in modo marcato sia il danno cutaneo indotto da UVC sia gli aumenti dell'AF verde della pelle dei topi indotti da UVC

Abbiamo determinato gli effetti dell'irraggiamento con UVC a 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2 sul danno cutaneo dei topi: l'irraggiamento con UVC a 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2 ha prodotto un danno significativo alla pelle dei topi (Figura 1A). La quantificazione del danno cutaneo ha indicato che l'UVC ha prodotto un danno significativo e dose-dipendente alla pelle (Figura 1B). Inoltre, le dosi di irraggiamento erano fortemente correlate ai livelli di danno cutaneo (Figura 1C).

Abbiamo determinato anche gli effetti dell'irraggiamento con UVC a 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2 sull'intensità dell'AF verde nei topi: l'irraggiamento con UVC a 0, 0,3, 0,6 e 0,9 J/cm2 ha prodotto aumenti evidenti dell'AF verde della pelle dei topi (Figura 2A). La quantificazione dell'intensità dell'AF verde ha indicato che l'UVC ha prodotto aumenti significativi e dose-dipendenti dell'intensità dell'AF verde della pelle (Figura 2B). Le dosi di irraggiamento erano fortemente correlate ai livelli di intensità dell'AF verde (Figura 2C). Inoltre, si è osservata una forte correlazione tra i livelli di intensità dell'AF verde e i livelli di danno cutaneo (Figura 2D).

Abbiamo poi determinato gli effetti della somministrazione di NAD+ sul danno cutaneo indotto da UVC: la somministrazione di NAD+ ha ridotto in modo netto il danno cutaneo indotto da UVC (Figura 3A). La quantificazione dei dati ha indicato che la somministrazione di NAD+ ha ridotto in modo significativo il danno cutaneo indotto da UVC (Figura 3B). La somministrazione di NAD+ ha inoltre attenuato in modo evidente gli aumenti dell'intensità dell'AF verde della pelle dei topi indotti da UVC (Figura 3C). La quantificazione dei dati ha indicato che la somministrazione di NAD+ ha ridotto in modo significativo gli aumenti, indotti da UVC, dell'intensità dell'AF verde della pelle dei topi (Figura 3D).

La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo le riduzioni, indotte da UVC, dei livelli di superossido dismutasi mitocondriale (SOD2) e catalasi, oltre agli aumenti dei livelli di COX2 indotti da UVC nella pelle dei topi

Figura 3. La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo marcato sia il danno cutaneo indotto da UVC sia gli aumenti dell'AF verde della pelle dei topi indotti da UVC. A, B. La somministrazione di NAD+ ha ridotto in modo significativo il danno cutaneo indotto da UVC. N = 3. ***, P < 0,001. Barra di scala = 100 μm. C, D. La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo gli aumenti dell'intensità dell'AF verde della pelle dei topi indotti da UVC. Dopo la somministrazione di 1 mg/kg di NAD+, i topi sono stati esposti a irraggiamento UVC alla dose di 0,6 J/cm2. Tre giorni dopo l'irraggiamento il danno cutaneo è stato determinato mediante colorazione H&E. L'AF verde della pelle è stata determinata con un microscopio confocale. N = 10. ***, P < 0,001. Barra di scala = 20 μm.

Abbiamo osservato che l'UVC ha indotto riduzioni significative dell'attività di SOD2 nella pelle dei topi, che sono state attenuate in modo significativo dalla somministrazione di NAD+ (Figura 4A e 4B). L'UVC ha indotto anche riduzioni significative dei livelli di catalasi nella pelle dei topi, anch'esse attenuate in modo significativo dalla somministrazione di NAD+ (Figura 4C, 4D).

Abbiamo inoltre osservato che l'UVC ha indotto aumenti significativi dei livelli di COX2, un marcatore di infiammazione [16], nella pelle dei topi (Figura 5A, 5B). La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo gli aumenti dei livelli di COX2 indotti da UVC (Figura 5A, 5B).

La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo gli aumenti del danno al dsDNA indotti da UVC nella pelle dei topi

I nostri saggi di Western blot hanno mostrato che l'UVC ha indotto aumenti significativi dei livelli della proteina fosforilata γ-H2AX, un indice di danno al dsDNA [17] (Figura 6A, 6B). La somministrazione di NAD+ ha prevenuto gli aumenti, indotti da UVC, di γ-H2AX (Figura 6A, 6B). Anche i saggi di immunocolorazione hanno mostrato che l'UVC ha indotto aumenti evidenti dei livelli proteici di γ-H2AX, prevenuti dalla somministrazione di NAD+ (Figura 6C).

Abbiamo poi determinato gli effetti della somministrazione di NAD+ sui segnali apoptotici indotti da UVC: l'UVC ha indotto riduzioni significative dei livelli di Bcl-2, una proteina anti-apoptotica fondamentale [18], prevenute dalla somministrazione di NAD+ (Figura 7A, 7B). Al contrario, l'UVC non ha modificato in modo significativo i livelli di Bax, un'importante proteina pro-apoptotica [18], che non sono stati influenzati dalla somministrazione di NAD+ (Figura 7A, 7C). Nel complesso, l'UVC ha indotto riduzioni significative del rapporto Bcl-2/Bax, attenuate in modo significativo dalla somministrazione di NAD+ (Figura 7D).

Discussione

I principali risultati del nostro studio sono i seguenti. Primo: l'AF verde della pelle indotta da UVC era fortemente correlata all'entità del danno cutaneo indotto da UVC; secondo: la somministrazione di NAD+ ha ridotto in modo marcato il danno cutaneo indotto da UVC; terzo: la somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo le riduzioni, indotte da UVC, dei livelli cutanei di superossido dismutasi mitocondriale e catalasi; quarto: la somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo l'aumento, indotto da UVC, del livello cutaneo di COX2; quinto: la somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo marcato l'aumento, indotto da UVC, del danno al dsDNA della pelle; e sesto: la somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo marcato le riduzioni, indotte da UVC, del rapporto Bcl-2/Bax nella pelle.

Figura 4. La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo le riduzioni, indotte da UVC, dei livelli di SOD2 e catalasi nella pelle dei topi. A, B. L'UVC ha indotto riduzioni significative dei livelli di SOD2 nella pelle dei topi, attenuate in modo significativo dalla somministrazione di NAD+. N = 16; *, P < 0,05. C, D. L'UVC ha indotto riduzioni significative dei livelli di catalasi nella pelle dei topi, attenuate in modo significativo dalla somministrazione di NAD+. Dopo la somministrazione di 1 mg/kg di NAD+, i topi sono stati esposti a irraggiamento UVC alla dose di 0,6 J/cm2. Un'ora dopo l'irraggiamento, i livelli cutanei di SOD2 e catalasi sono stati determinati mediante Western blot. N = 6. *, P < 0,05.

Figura 5. La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo gli aumenti, indotti da UVC, dei livelli di COX2 nella pelle dei topi. A, B. L'UVC ha indotto aumenti significativi dei livelli di COX2 nella pelle dei topi, attenuati in modo significativo dalla somministrazione di NAD+. Dopo la somministrazione di 1 mg/kg di NAD+, i topi sono stati esposti a irraggiamento UVC alla dose di 0,6 J/cm2. Un'ora dopo l'irraggiamento, i livelli cutanei di COX2 sono stati determinati mediante Western blot. N = 6; *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

La radiazione UV è un importante fattore di rischio per numerose malattie della pelle, compreso il tumore cutaneo [6-8]. Sebbene diversi studi abbiano individuato agenti protettivi per la pelle, resta molto rilevante scoprire nuovi agenti in grado di offrire protezione dal danno cutaneo indotto dagli UV. A causa del progressivo assottigliamento dello strato di ozono atmosferico, la radiazione UVC che raggiunge la superficie terrestre è aumentata e rappresenta una preoccupazione ambientale sempre più rilevante [14]. Essendo una radiazione ionizzante, l'UVC è un potente mutageno in grado di causare tumori e malattie immuno-mediate [14]. È quindi molto utile cercare agenti capaci di ridurre in modo marcato il danno cutaneo indotto da UVC. Il presente studio fornisce evidenze solide che indicano come il NAD+ sia, in questo modello sperimentale, un agente efficace nel ridurre il danno cutaneo indotto da UVC. Lo studio indica inoltre i meccanismi alla base degli effetti protettivi del NAD+ sul danno cutaneo indotto da UVC: il NAD+ può ridurre il danno cutaneo indotto da UVC attenuando lo stress ossidativo indotto da UVC, l'infiammazione, il danno al DNA e l'apoptosi.

Il nostro studio indica i meccanismi alla base della protezione esercitata dal NAD+ sul danno cutaneo indotto da UVC: abbiamo osservato che la somministrazione di NAD+ può attenuare in modo marcato le riduzioni, indotte da UVC, del rapporto Bcl-2/Bax, un indicatore dei segnali apoptotici, il che suggerisce che la somministrazione di NAD+ riduca il danno cutaneo indotto da UVC almeno in parte diminuendo l'apoptosi cutanea indotta da UVC. Poiché il danno al dsDNA è un importante induttore di apoptosi [19], il fatto che la somministrazione di NAD+ possa attenuare gli aumenti del danno al dsDNA indotti da UVC suggerisce che essa riduca l'apoptosi indotta da UVC almeno in parte attenuando il danno al dsDNA indotto da UVC.

Figura 6. La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo gli aumenti, indotti da UVC, dei livelli di γ-H2AX nella pelle dei topi. A, B. L'UVC ha indotto aumenti significativi dei livelli proteici di γ-H2AX nella pelle dei topi, attenuati in modo significativo dalla somministrazione di NAD+. C. I saggi di immunocolorazione hanno mostrato che l'UVC ha indotto aumenti dei livelli proteici di γ-H2AX nella pelle dei topi, attenuati dalla somministrazione di NAD+. Dopo la somministrazione di 1 mg/kg di NAD+, i topi sono stati esposti a irraggiamento UVC alla dose di 0,6 J/cm2. Un'ora dopo l'irraggiamento, i livelli cutanei di γ-H2AX sono stati determinati mediante Western blot o immunocolorazione. N = 7. *, P < 0,05. Barra di scala = 20 μm.

Essendo l'UVC una radiazione ionizzante, può indurre un aumento dello stress ossidativo nella pelle [6-8], fattore patologico importante nel danno cutaneo indotto da UVC. È quindi atteso che nel nostro studio l'UVC abbia ridotto l'attività della catalasi e di SOD2. Lo studio ha mostrato che la somministrazione di NAD+ può attenuare in modo significativo le riduzioni, indotte da UVC, dell'attività di SOD2 e della catalasi, il che indica che il NAD+ riduce il danno cutaneo indotto da UVC almeno in parte attenuando lo stress ossidativo. Poiché lo stress ossidativo è un induttore di danno al dsDNA [20] e di apoptosi [21], il nostro risultato suggerisce che la somministrazione di NAD+ possa attenuare gli aumenti, indotti da UVC, del danno al dsDNA e dell'apoptosi almeno in parte riducendo lo stress ossidativo. L'infiammazione è un fattore patologico determinante nel danno cutaneo indotto dagli UV [22]. Il nostro studio ha rilevato che la somministrazione di NAD+ può attenuare in modo significativo l'aumento, indotto da UVC, dei livelli di COX2, il che suggerisce che una riduzione dell'infiammazione possa essere un altro meccanismo importante alla base degli effetti benefici del NAD+ sul danno cutaneo indotto da UVC.

I nostri studi indicano che l'AF verde della pelle è un nuovo biomarcatore per la diagnosi di diverse malattie di rilievo, tra cui l'ictus ischemico acuto e il tumore del polmone [23]. Un nostro studio recente ha indicato inoltre che l'intensità dell'AF verde della pelle è un biomarcatore utile a predire il danno cutaneo indotto da UVC [15]. Il presente studio fornisce ulteriori evidenze a sostegno di questo risultato: l'AF verde della pelle indotta da UVC era fortemente correlata al danno cutaneo indotto da UVC. Questo nuovo metodo ha quindi un buon potenziale per applicazioni future nella previsione del danno cutaneo indotto da UVC.

In conclusione, il presente studio non solo indica il NAD+ come nuovo agente in grado di ridurre il danno cutaneo indotto da UVC in questo modello sperimentale, ma fornisce anche ulteriori evidenze a sostegno della validità della nostra tecnologia per la previsione del danno cutaneo indotto da UVC. È opportuno indagare ulteriormente i meccanismi alla base della validità di questa tecnologia.

Figura 7. La somministrazione di NAD+ ha attenuato in modo significativo le riduzioni, indotte da UVC, del rapporto Bcl-2/Bax nella pelle dei topi. A, B. L'UVC ha indotto riduzioni significative dei livelli di Bcl-2, prevenute dal pre-trattamento con NAD+. A, C. L'UVC non ha modificato in modo significativo i livelli di Bax, che non sono stati influenzati dalla pre-somministrazione di NAD+. D. L'UVC ha indotto riduzioni significative del rapporto Bcl-2/Bax, prevenute dalla somministrazione di NAD+. Dopo la somministrazione di 1 mg/kg di NAD+, i topi sono stati esposti a irraggiamento UVC alla dose di 0,6 J/cm2. Un'ora dopo l'irraggiamento, i livelli cutanei di Bcl-2 e Bax sono stati determinati mediante Western blot. N = 6; *, P < 0,05.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare per il sostegno finanziario lo Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant n. 2017SHZDZX01) (a W.Y.) e il SJTUSTAR Medical-Engineering Interdisciplinary Youth Fund finanziato dalla Shanghai Jiao Tong University (YG2019QNA36) a Y.Z.

Dichiarazione sui conflitti di interesse

Nessuno.

Indirizzo per la corrispondenza: Dr. Weihai Ying, School of Biomedical Engineering and Med-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, P. R. China. E-mail: weihaiy@sjtu.edu.cn; Dr. Mingchao Zhang, Multiscale Research Institute of Complex Systems, Fudan University, Shanghai 200433, P. R. China. E-mail: 1058697003@qq.com

Bibliografia