Η χορήγηση NAD+ μειώνει σημαντικά τη βλάβη του δέρματος από UVC, περιορίζοντας το οξειδωτικό στρες, τη φλεγμονή, τη βλάβη του DNA και την απόπτωση

-> Κατεβάστε το πρωτότυπο άρθρο εδώ

Mengmeng Li1, Mingchao Zhang1,2, Yin Zhang3, Yu Liang3, Weihai Ying1

1Med-X Research Institute and School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, P. R. China; 2Multiscale Research Institute of Complex Systems, Fudan University, Shanghai 200433, P. R. China; 3Department of Orthopedics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 197 Ruijin 2nd Road, Shanghai 200025, P. R. China

Παραλαβή: 6 Μαρτίου 2023· Αποδοχή: 4 Απριλίου 2023· Ηλεκτρονική δημοσίευση: 15 Απριλίου 2023· Δημοσίευση: 30 Απριλίου 2023

Περίληψη: Η υπεριώδης (UV) ακτινοβολία αποτελεί κύρια αιτία πολλών σοβαρών δερματικών παθήσεων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του δέρματος. Είναι ζωτικής σημασίας να ανακαλυφθούν νέοι παράγοντες που μπορούν να ασκήσουν ισχυρή προστατευτική δράση έναντι των βλαβών του δέρματος που προκαλεί η UV ακτινοβολία. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ποντικού, στην παρούσα μελέτη προσδιορίσαμε τις επιδράσεις του NAD+ στη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC και διερευνήσαμε τους μηχανισμούς που διέπουν αυτές τις επιδράσεις, καταλήγοντας στα εξής ευρήματα: πρώτον, ο πράσινος αυτοφθορισμός (AF) του δέρματος που προκαλείται από την UVC συσχετιζόταν σε υψηλό βαθμό με την έκταση της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC· δεύτερον, η χορήγηση NAD+ μείωσε σε μεγάλο βαθμό τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC· τρίτον, η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις μειώσεις που προκαλεί η UVC στα επίπεδα της μιτοχονδριακής υπεροξειδικής δισμουτάσης και της καταλάσης· τέταρτον, η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά την αύξηση που προκαλεί η UVC στο επίπεδο της κυκλοοξυγενάσης (COX) 2, ενός δείκτη φλεγμονής· πέμπτον, η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σε μεγάλο βαθμό την αύξηση που προκαλεί η UVC στη βλάβη του δίκλωνου DNA (dsDNA)· και έκτον, η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σε μεγάλο βαθμό τις μειώσεις που προκαλεί η UVC στους λόγους Bcl-2/Bax, έναν δείκτη απόπτωσης. Συνολικά, η μελέτη μας διαπίστωσε ότι η χορήγηση NAD+ μπορεί να μειώσει σε μεγάλο βαθμό τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC, εξασθενώντας το οξειδωτικό στρες, τη φλεγμονή, τη βλάβη του DNA και την απόπτωση, γεγονός που υποδηλώνει μεγάλες δυνατότητες του NAD+ ως προστατευτικού παράγοντα για τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC. Επιπλέον, η μελέτη μας έδειξε περαιτέρω ότι ο πράσινος AF του δέρματος είναι ένας βιοδείκτης για την πρόβλεψη της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC.

Λέξεις-κλειδιά: NAD+, UV, βλάβη του δέρματος, απόπτωση, πράσινος αυτοφθορισμός

Εισαγωγή

Το NAD+ διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο σε μια σειρά σημαντικών βιολογικών διεργασιών, όπως ο ενεργειακός μεταβολισμός, η μιτοχονδριακή λειτουργία, ο κυτταρικός θάνατος, η επιδιόρθωση του DNA και οι ανοσολογικές λειτουργίες [1, 2]. Συσσωρευμένα δεδομένα έχουν δείξει ότι το NAD+ μπορεί να έχει σημαντικές ευεργετικές επιδράσεις σε πολλά ζωικά μοντέλα ασθενειών, όπως η ισχαιμική εγκεφαλική βλάβη και η ισχαιμική βλάβη του μυοκαρδίου [3-5]. Δικαιολογείται να προσδιοριστούν περαιτέρω οι επιδράσεις του NAD+ σε διάφορα μοντέλα ασθενειών και να διερευνηθούν περαιτέρω οι μηχανισμοί που διέπουν τις επιδράσεις του NAD+ στη βλάβη ιστών και οργάνων [3].

Η ακτινοβολία UV είναι κρίσιμη αιτία πολλών δερματικών παθήσεων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του δέρματος [6-8]. Η ακτινοβολία UV μπορεί να προκαλέσει πολλαπλές παθολογικές αλλαγές στο δέρμα, όπως η φωτογήρανση και ο καρκίνος του δέρματος [8, 9], οι οποίες οφείλονται στην ικανότητά της να προκαλεί στο δέρμα αλλοιώσεις όπως το οξειδωτικό στρες, η φλεγμονή, η βλάβη του DNA και η απόπτωση [10, 11]. Παρόλο που πολλές μελέτες έχουν εντοπίσει παράγοντες προστασίας του δέρματος [12, 13], έχει μεγάλη σημασία να ανακαλυφθούν νέοι παράγοντες που μπορούν να προσφέρουν ισχυρή προστασία έναντι της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UV.

Υπάρχουν τρεις κύριοι τύποι ακτινοβολίας UV: UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) και UVC (100-280 nm) [8]. Λόγω της σταδιακής εξάντλησης του ατμοσφαιρικού στρώματος του όζοντος, η ακτινοβολία UVC στην επιφάνεια της γης έχει αυξηθεί, κάτι που γίνεται ολοένα και πιο σημαντικό περιβαλλοντικό ζήτημα [14]. Επειδή πρόκειται για ιονίζουσα ακτινοβολία, η UVC είναι ισχυρός μεταλλαξιογόνος παράγοντας που μπορεί να προκαλέσει καρκίνο και ανοσολογικά διαμεσολαβούμενες ασθένειες [14]. Οι περισσότερες μελέτες για προστατευτικούς παράγοντες έναντι της ακτινοβολίας UV έχουν επικεντρωθεί σε παράγοντες που προστατεύουν από τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVB ή την UVA [12, 13]. Επομένως, είναι ιδιαίτερα πολύτιμο να αναζητηθούν παράγοντες που μπορούν να μειώσουν σε μεγάλο βαθμό τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC.

Έχει σημασία να ανακαλυφθούν βιοδείκτες για τη μη επεμβατική πρόβλεψη της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UV, οι οποίοι μπορούν να αυξήσουν σημαντικά την ικανότητά μας για έγκαιρη διάγνωση και παρέμβαση στη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UV [15]. Η πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι η ένταση του πράσινου AF του δέρματος είναι βιοδείκτης για την πρόβλεψη της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVB/UVC [15]. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω στοιχεία για να υποστηριχθεί και να εδραιωθεί αυτό το εύρημα, ώστε να καθιερωθεί αυτή η νέα προσέγγιση στην έγκαιρη διάγνωση και παρέμβαση στη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UV.

Στην παρούσα μελέτη, επικεντρωθήκαμε στον προσδιορισμό των επιδράσεων του NAD+ στη βλάβη του δέρματος ποντικών που προκαλείται από την UVC και διερευνήσαμε τους μηχανισμούς που διέπουν αυτές τις επιδράσεις. Επίσης, ελέγξαμε περαιτέρω την εγκυρότητα της πρόβλεψης της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC με βάση τον πράσινο AF. Η μελέτη μας έδειξε ότι η χορήγηση NAD+ μπορεί να μειώσει σε μεγάλο βαθμό τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC, εξασθενώντας το οξειδωτικό στρες, τη φλεγμονή, τη βλάβη του DNA και την απόπτωση. Η μελέτη μας συγκέντρωσε επίσης περαιτέρω στοιχεία που επιβεβαιώνουν την εγκυρότητα της μεθόδου που βασίζεται στον πράσινο AF για την πρόβλεψη της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC.

Υλικά και μέθοδοι

Υλικά

Η φορμαλίνη, η αιματοξυλίνη, η ηωσίνη και το NAD+ αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Τα αντισώματα SOD2 και Actin αποκτήθηκαν από τη Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Το αντίσωμα γ-H2AX αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, UK). Τα αντισώματα Bcl-2, Bax, Catalase και COX2 αποκτήθηκαν από την Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ήταν της υψηλότερης διαθέσιμης στο εμπόριο ποιότητας.

Παρασκευή διαλυμάτων NAD+

Το έκδοχο παρασκευάστηκε με ανάμειξη ίσων όγκων PBS και γλυκερόλης. Ένα πυκνό διάλυμα NAD+ με τελική συγκέντρωση 10 mg/ml παρασκευάστηκε με προσθήκη NAD+ στο έκδοχο. Το NAD+ χορηγήθηκε σε δόση 1 mg/cm2 σε κάθε αυτί.

Πειράματα σε ζώα

Αρσενικοί ποντικοί C57BL/6 ηλικίας 6-8 εβδομάδων και βάρους 18-22 g (Lingchang Biotechnology Co., LTD., Shanghai) διατηρήθηκαν σε εγκατάσταση ζώων SPF με ελεγχόμενη θερμοκρασία και υγρασία. Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο για τα ζώα που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Βιοηθικής της School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University. Μετά από μία εβδομάδα παρατήρησης, οι ποντικοί ακτινοβολήθηκαν με UVC σε δόσεις ακτινοβολίας 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2. 18-24 ώρες μετά την ακτινοβολία, ο πράσινος AF των αυτιών προσδιορίστηκε με μικροσκόπιο δύο φωτονίων (Nikon, Shanghai, China). Τρεις ημέρες μετά την ακτινοβολία, τα αυτιά συλλέχθηκαν και φυλάχθηκαν στους -80°C.

Απεικόνιση του πράσινου AF του δέρματος: Η απεικόνιση του πράσινου AF του δέρματος πραγματοποιήθηκε όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [15]. Ο AF του δέρματος των αυτιών των ποντικών απεικονίστηκε με μικροσκόπιο φθορισμού (A1 plus, Nikon Instech Co., Ltd., Tokyo, Japan) σε λειτουργία ενός φωτονίου, με μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και μήκος κύματος εκπομπής 500-530 nm. Ο AF ποσοτικοποιήθηκε με την ακόλουθη προσέγγιση: Επιλέχθηκαν τυχαία δεκαέξι σημεία μεγέθους 100 μm × 100 μm στις σαρωμένες εικόνες. Υπολογίστηκε η μέση ένταση AF κάθε στρώσης και στη συνέχεια υπολογίστηκε το άθροισμα της μέσης έντασης AF όλων των στρώσεων κάθε σημείου, το οποίο ορίζεται ως η ένταση AF κάθε σημείου.

Ιστολογικές αναλύσεις: Οι ιστολογικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως έχει περιγραφεί προηγουμένως [15]. Λήφθηκαν βιοψίες δέρματος από τα αυτιά των ποντικών, οι οποίες τοποθετήθηκαν αμέσως σε ρυθμιστικό διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% (w/v). Μετά από 12 έως 24 ώρες, πραγματοποιήθηκε εγκλεισμός των δειγμάτων σε παραφίνη. Η χρώση αιματοξυλίνης & ηωσίνης (H&E) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (C0105, Beyotime, Haimen, China).

Χρώση ανοσοφθορισμού: Οι τομές παραφίνης αποπαραφινώθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν με Triton X-100 0,2% σε PBS για 10 λεπτά.

Εικόνα 1. Η UVC προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη βλάβη στο δέρμα των ποντικών. A, B. Η ακτινοβολία με 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2 UVC προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη βλάβη στο δέρμα των ποντικών. C. Οι δόσεις της ακτινοβολίας συσχετίζονταν σε υψηλό βαθμό με τα επίπεδα της βλάβης του δέρματος. Οι ποντικοί εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UVC σε δόσεις 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2. Τρεις ημέρες μετά την ακτινοβολία, η βλάβη του δέρματος προσδιορίστηκε με χρώση H&E. N = 3. *, P < 0,05· **, P < 0,01. Κλίμακα = 100 μm.

Μετά από πλύσεις με PBS, οι τομές αποκλείστηκαν με ορό αίγας 10% για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα anti-γ-H2AX (ab81299, Cell Signaling Technology, MA, USA) (αραίωση 1:250) σε PBS που περιείχε ορό αίγας 1%, κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS, οι τομές επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor® 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) (αραίωση 1:500, Molecular Probes, Eugene, Oregon, United States) σε PBS που περιείχε ορό αίγας 1% για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS, οι τομές υποβλήθηκαν σε αντιχρώση με DAPI (αραίωση 1:1000, Beyotime Institute of Biotechnology) σε PBS για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι εικόνες φθορισμού φωτογραφήθηκαν με συνεστιακό μικροσκόπιο Leica (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).

Ανοσοαποτύπωση Western

Το δέρμα των αυτιών των ποντικών συλλέχθηκε και λύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Millipore, Temecula, California, United States) που περιείχε 1% μείγμα αναστολέων πρωτεασών, 1% μείγμα αναστολέων φωσφατασών (CWBio, Beijing, China) και 1 mM φθοριούχο φαινυλομεθανοσουλφονύλιο. Τα λύματα φυγοκεντρήθηκαν στις 12000 rpm για 20 λεπτά στους 4°C. Μετά την ποσοτικοποίηση των δειγμάτων πρωτεΐνης με το BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, United States), 30 μg ολικής πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου 10% και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης 0,45 μm. Οι αποτυπώσεις επωάστηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4°C με πρωτογενή αντισώματα στις ακόλουθες αραιώσεις: αντίσωμα anti-COX2 (Cat#12-282, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (αραίωση 1:1000), αντίσωμα anti-SOD2 (sc-133134, Santa Cruz, California, United States) (αραίωση 1:2000), αντίσωμα anti-catalase (Cat#14097, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (αραίωση 1:2000), αντίσωμα anti-Bcl-2 (Cat#3498, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (αραίωση 1:2000), αντίσωμα anti-Bax (Cat#5023, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (αραίωση 1:2000), αντίσωμα anti-γ-H2AX (ab81299, Abcam, Cambridge, UK) (αραίωση 1:4000) και αντίσωμα anti-Actin (sc-58673 Santa Cruz, California, United States) (αραίωση 1:1000). Στη συνέχεια, οι αποτυπώσεις επωάστηκαν με HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (αραίωση 1:4000) (Jackson ImmunoResearch, PA, USA) ή HRP conjugated Goat Anti-mouse IgG (αραίωση 1:4000, HA1006, HuaBio, Zhejiang Province, China). Τα σήματα των πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν με σύστημα ανίχνευσης ECL (Thermo Scientific, Pierce, IL, USA). Οι εντάσεις των ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το Image J.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως μέσοι όροι ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ανάλυση διακύμανσης δύο παραγόντων, ακολουθούμενη από έλεγχο Bonferroni post hoc. Τιμές P μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Εικόνα 2. Η UVC προκάλεσε δοσοεξαρτώμενες αυξήσεις στην ένταση του πράσινου AF του δέρματος των ποντικών. A, B. Η ακτινοβολία με 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2 UVC προκάλεσε σημαντικές και δοσοεξαρτώμενες αυξήσεις στον πράσινο AF του δέρματος των ποντικών. C. Οι δόσεις της ακτινοβολίας συσχετίζονταν σε υψηλό βαθμό με τα επίπεδα της έντασης του πράσινου AF. D. Υπήρχε υψηλή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της έντασης του πράσινου AF και των επιπέδων της βλάβης του δέρματος. Οι ποντικοί εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UVC σε δόσεις 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2. 18 έως 24 ώρες μετά την ακτινοβολία, ο πράσινος AF του δέρματος προσδιορίστηκε με συνεστιακό μικροσκόπιο. N = 9. *, P < 0,05· ***, P < 0,001. Κλίμακα = 20 μm.

Αποτελέσματα

Η χορήγηση NAD+ μείωσε σε μεγάλο βαθμό τόσο τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC όσο και τις αυξήσεις του πράσινου AF του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC

Προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της ακτινοβολίας με 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2 UVC στη βλάβη του δέρματος των ποντικών: Η ακτινοβολία των ποντικών με 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2 UVC προκάλεσε σημαντική βλάβη στο δέρμα των ποντικών (Εικόνα 1A). Η ποσοτικοποίηση της βλάβης του δέρματος έδειξε ότι η UVC προκάλεσε σημαντική και δοσοεξαρτώμενη βλάβη του δέρματος (Εικόνα 1B). Επιπλέον, οι δόσεις της ακτινοβολίας συσχετίζονταν σε υψηλό βαθμό με τα επίπεδα της βλάβης του δέρματος (Εικόνα 1C).

Προσδιορίσαμε επίσης τις επιδράσεις της ακτινοβολίας με 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2 UVC στην ένταση του πράσινου AF των ποντικών: Η ακτινοβολία με 0, 0,3, 0,6 και 0,9 J/cm2 UVC προκάλεσε εμφανείς αυξήσεις στον πράσινο AF του δέρματος των ποντικών (Εικόνα 2A). Η ποσοτικοποίηση της έντασης του πράσινου AF έδειξε ότι η UVC προκάλεσε σημαντικές και δοσοεξαρτώμενες αυξήσεις στην ένταση του πράσινου AF του δέρματος (Εικόνα 2B). Οι δόσεις της ακτινοβολίας συσχετίζονταν σε υψηλό βαθμό με τα επίπεδα της έντασης του πράσινου AF (Εικόνα 2C). Επιπλέον, υπήρχε υψηλή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της έντασης του πράσινου AF και των επιπέδων της βλάβης του δέρματος (Εικόνα 2D).

Προσδιορίσαμε περαιτέρω τις επιδράσεις της χορήγησης NAD+ στη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC: Η χορήγηση NAD+ μείωσε αισθητά τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC (Εικόνα 3A). Η ποσοτικοποίηση των δεδομένων έδειξε ότι η χορήγηση NAD+ μείωσε σημαντικά τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC (Εικόνα 3B). Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε επίσης εμφανώς τις αυξήσεις στην ένταση του πράσινου AF του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC (Εικόνα 3C). Η ποσοτικοποίηση των δεδομένων έδειξε ότι η χορήγηση NAD+ μείωσε σημαντικά τις αυξήσεις στην ένταση του πράσινου AF του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC (Εικόνα 3D).

Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις μειώσεις των επιπέδων της μιτοχονδριακής υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD2) και της καταλάσης που προκαλούνται από την UVC, καθώς και τις αυξήσεις των επιπέδων COX2 του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC

Εικόνα 3. Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σε μεγάλο βαθμό τόσο τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC όσο και τις αυξήσεις του πράσινου AF του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC. A, B. Η χορήγηση NAD+ μείωσε σημαντικά τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC. N = 3. ***, P < 0,001. Κλίμακα = 100 μm. C, D. Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις αυξήσεις στην ένταση του πράσινου AF του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC. Αφού χορηγήθηκε στους ποντικούς 1 mg/kg NAD+, οι ποντικοί εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UVC σε δόση 0,6 J/cm2. Τρεις ημέρες μετά την ακτινοβολία, η βλάβη του δέρματος προσδιορίστηκε με χρώση H&E. Ο πράσινος AF του δέρματος προσδιορίστηκε με συνεστιακό μικροσκόπιο. N = 10. ***, P < 0,001. Κλίμακα = 20 μm.

Διαπιστώσαμε ότι η UVC προκάλεσε σημαντικές μειώσεις στη δραστηριότητα της SOD2 του δέρματος των ποντικών, οι οποίες εξασθενήθηκαν σημαντικά με τη χορήγηση NAD+ (Εικόνα 4A και 4B). Η UVC προκάλεσε επίσης σημαντικές μειώσεις στα επίπεδα της καταλάσης του δέρματος των ποντικών, οι οποίες εξασθενήθηκαν σημαντικά με τη χορήγηση NAD+ (Εικόνα 4C, 4D).

Διαπιστώσαμε περαιτέρω ότι η UVC προκάλεσε σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα COX2 (ενός δείκτη φλεγμονής [16]) του δέρματος των ποντικών (Εικόνα 5A, 5B). Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις αυξήσεις των επιπέδων COX2 που προκαλούνται από την UVC (Εικόνα 5A, 5B).

Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις αυξήσεις της βλάβης του dsDNA του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC

Οι αναλύσεις Western blot που πραγματοποιήσαμε έδειξαν ότι η UVC προκάλεσε σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης γ-H2AX, ενός δείκτη βλάβης του dsDNA [17] (Εικόνα 6A, 6B). Η χορήγηση NAD+ απέτρεψε τις αυξήσεις της γ-H2AX που προκαλούνται από την UVC (Εικόνα 6A, 6B). Οι αναλύσεις ανοσοχρώσης που πραγματοποιήσαμε έδειξαν επίσης ότι η UVC προκάλεσε εμφανείς αυξήσεις στα επίπεδα της πρωτεΐνης γ-H2AX, οι οποίες αποτράπηκαν με τη χορήγηση NAD+ (Εικόνα 6C).

Προσδιορίσαμε περαιτέρω τις επιδράσεις της χορήγησης NAD+ στα αποπτωτικά σήματα που προκαλούνται από την UVC: Η UVC προκάλεσε σημαντικές μειώσεις στα επίπεδα της Bcl-2, μιας κρίσιμης αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης [18], οι οποίες αποτράπηκαν με τη χορήγηση NAD+ (Εικόνα 7A, 7B). Αντίθετα, η UVC δεν επηρέασε σημαντικά τα επίπεδα της Bax, μιας σημαντικής προαποπτωτικής πρωτεΐνης [18], τα οποία δεν επηρεάστηκαν από τη χορήγηση NAD+ (Εικόνα 7A, 7C). Συνολικά, η UVC προκάλεσε σημαντικές μειώσεις στους λόγους Bcl-2/Bax, οι οποίες εξασθενήθηκαν σημαντικά με τη χορήγηση NAD+ (Εικόνα 7D).

Συζήτηση

Τα κύρια ευρήματα της μελέτης μας περιλαμβάνουν: πρώτον, ο πράσινος AF του δέρματος που προκαλείται από την UVC συσχετιζόταν σε υψηλό βαθμό με την έκταση της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC· δεύτερον, η χορήγηση NAD+ μείωσε σε μεγάλο βαθμό τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC· τρίτον, η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις μειώσεις των επιπέδων της μιτοχονδριακής υπεροξειδικής δισμουτάσης και της καταλάσης του δέρματος που προκαλούνται από την UVC· τέταρτον, η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά την αύξηση του επιπέδου COX2 του δέρματος που προκαλείται από την UVC· πέμπτον, η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σε μεγάλο βαθμό την αύξηση της βλάβης του sDNA του δέρματος που προκαλείται από την UVC· και έκτον, η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σε μεγάλο βαθμό τις μειώσεις στους λόγους Bcl-2/ Bax του δέρματος που προκαλούνται από την UVC.

Εικόνα 4. Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις μειώσεις των επιπέδων SOD2 και καταλάσης στο δέρμα των ποντικών που προκαλούνται από την UVC. A, B. Η UVC προκάλεσε σημαντικές μειώσεις στα επίπεδα SOD2 στο δέρμα των ποντικών, οι οποίες εξασθενήθηκαν σημαντικά με τη χορήγηση NAD+. N = 16· *, P < 0,05. C, D. Η UVC προκάλεσε σημαντικές μειώσεις στα επίπεδα καταλάσης στο δέρμα των ποντικών, οι οποίες εξασθενήθηκαν σημαντικά με τη χορήγηση NAD+. Αφού χορηγήθηκε στους ποντικούς 1 mg/kg NAD+, οι ποντικοί εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UVC σε δόση 0,6 J/cm2. Μία ώρα μετά την ακτινοβολία, τα επίπεδα SOD2 και τα επίπεδα καταλάσης του δέρματος προσδιορίστηκαν με αναλύσεις Western blot. N = 6. *, P < 0,05.

Εικόνα 5. Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις αυξήσεις των επιπέδων COX2 του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC. A, B. Η UVC προκάλεσε σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα COX2 του δέρματος των ποντικών, οι οποίες εξασθενήθηκαν σημαντικά με τη χορήγηση NAD+. Αφού χορηγήθηκε στους ποντικούς 1 mg/kg NAD+, οι ποντικοί εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UVC σε δόση 0,6 J/cm2. Μία ώρα μετά την ακτινοβολία, τα επίπεδα COX2 του δέρματος προσδιορίστηκαν με αναλύσεις Western blot. N = 6· *, P < 0,05· **, P < 0,01· ***, P < 0,001.

Η ακτινοβολία UV αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου για μια σειρά δερματικών παθήσεων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του δέρματος [6-8]. Παρόλο που πολλές μελέτες έχουν εντοπίσει παράγοντες προστασίας του δέρματος, έχει μεγάλη σημασία να ανακαλυφθούν νέοι παράγοντες που μπορούν να προσφέρουν προστασία έναντι της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UV. Λόγω της σταδιακής εξάντλησης του ατμοσφαιρικού στρώματος του όζοντος, η ακτινοβολία UVC στην επιφάνεια της γης έχει αυξηθεί, κάτι που γίνεται ολοένα και πιο σημαντικό περιβαλλοντικό ζήτημα [14]. Επειδή πρόκειται για ιονίζουσα ακτινοβολία, η UVC είναι ισχυρός μεταλλαξιογόνος παράγοντας που μπορεί να προκαλέσει καρκίνο και ανοσολογικά διαμεσολαβούμενες ασθένειες [14]. Επομένως, είναι ιδιαίτερα πολύτιμο να αναζητηθούν παράγοντες που μπορούν να μειώσουν σε μεγάλο βαθμό τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC. Η παρούσα μελέτη μας παρείχε ισχυρά στοιχεία που δείχνουν ότι το NAD+ είναι ένας ισχυρός παράγοντας που μπορεί να μειώσει τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC. Επιπλέον, η μελέτη μας ανέδειξε τους μηχανισμούς που διέπουν τις προστατευτικές επιδράσεις του NAD+ στη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC: Το NAD+ μπορεί να μειώσει τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC, εξασθενώντας το οξειδωτικό στρες, τη φλεγμονή, τη βλάβη του DNA και την απόπτωση που προκαλεί η UVC.

Η μελέτη μας ανέδειξε μηχανισμούς που διέπουν την προστασία που παρέχει το NAD+ έναντι της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC: Διαπιστώσαμε ότι η χορήγηση NAD+ μπορεί να εξασθενήσει σε μεγάλο βαθμό τις μειώσεις στον λόγο Bcl-2/Bax (έναν δείκτη αποπτωτικών σημάτων) που προκαλούνται από την UVC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χορήγηση NAD+ μειώνει τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC τουλάχιστον εν μέρει μειώνοντας την απόπτωση του δέρματος που προκαλείται από την UVC. Επειδή η βλάβη του dsDNA είναι σημαντικός επαγωγέας της απόπτωσης [19], το εύρημά μας ότι η χορήγηση NAD+ μπορεί να εξασθενήσει τις αυξήσεις της βλάβης του dsDNA που προκαλούνται από την UVC υποδηλώνει ότι η χορήγηση NAD+ μπορεί να μειώσει την απόπτωση που προκαλείται από την UVC τουλάχιστον εν μέρει εξασθενώντας τη βλάβη του dsDNA που προκαλείται από την UVC.

Εικόνα 6. Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις αυξήσεις των επιπέδων γ-H2AX του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC. A, B. Η UVC προκάλεσε σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα της πρωτεΐνης γ-H2AX του δέρματος των ποντικών, οι οποίες εξασθενήθηκαν σημαντικά με τη χορήγηση NAD+. C. Οι αναλύσεις ανοσοχρώσης έδειξαν ότι η UVC προκάλεσε αυξήσεις στα επίπεδα της πρωτεΐνης γ-H2AX του δέρματος των ποντικών, οι οποίες εξασθενήθηκαν με τη χορήγηση NAD+. Αφού χορηγήθηκε στους ποντικούς 1 mg/kg NAD+, οι ποντικοί εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UVC σε δόση 0,6 J/cm2. Μία ώρα μετά την ακτινοβολία, τα επίπεδα γ-H2AX του δέρματος προσδιορίστηκαν με αναλύσεις Western blot ή αναλύσεις ανοσοχρώσης. N = 7. *, P < 0,05. Κλίμακα = 20 μm.

Επειδή η UVC είναι ιονίζουσα ακτινοβολία, μπορεί να προκαλέσει αύξηση του οξειδωτικού στρες στο δέρμα [6-8], το οποίο αποτελεί σημαντικό παθολογικό παράγοντα στη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC. Επομένως, ήταν αναμενόμενο ότι η μελέτη μας θα έδειχνε ότι η UVC προκαλεί μειωμένη δραστηριότητα της καταλάσης και της SOD2. Η μελέτη μας έδειξε ότι η χορήγηση NAD+ μπορεί να εξασθενήσει σημαντικά τις μειώσεις της δραστηριότητας της SOD2 και της καταλάσης που προκαλούνται από την UVC, γεγονός που δείχνει ότι το NAD+ μειώνει τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC τουλάχιστον εν μέρει εξασθενώντας το οξειδωτικό στρες. Επειδή το οξειδωτικό στρες είναι επαγωγέας της βλάβης του dsDNA [20] και της απόπτωσης [21], το εύρημά μας υποδηλώνει ότι η χορήγηση NAD+ μπορεί να εξασθενήσει τις αυξήσεις της βλάβης του dsDNA και της απόπτωσης που προκαλούνται από την UVC τουλάχιστον εν μέρει μειώνοντας το οξειδωτικό στρες. Η φλεγμονή είναι κρίσιμος παθολογικός παράγοντας στη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UV [22]. Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι η χορήγηση NAD+ μπορεί να εξασθενήσει σημαντικά την αύξηση των επιπέδων COX2 που προκαλείται από την UVC, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μειώσεις της φλεγμονής που προκαλεί η UVC μπορεί να είναι ένας ακόμη σημαντικός μηχανισμός που διέπει τις ευεργετικές επιδράσεις του NAD+ στη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC.

Οι μελέτες μας έχουν δείξει ότι ο πράσινος AF του δέρματος είναι ένας νέος βιοδείκτης για τη διάγνωση πολλών σοβαρών ασθενειών, όπως το οξύ ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο και ο καρκίνος του πνεύμονα [23]. Η πρόσφατη μελέτη μας έδειξε επίσης ότι η ένταση του πράσινου AF του δέρματος είναι βιοδείκτης για την πρόβλεψη της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC [15]. Η παρούσα μελέτη μας παρείχε περαιτέρω στοιχεία που υποστηρίζουν αυτό το εύρημα: ο πράσινος AF του δέρματος που προκαλείται από την UVC συσχετιζόταν σε υψηλό βαθμό με τη βλάβη του δέρματος που προκαλείται από την UVC. Επομένως, αυτή η νέα μέθοδος έχει καλές προοπτικές για μελλοντικές εφαρμογές στην πρόβλεψη της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC.

Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη μας όχι μόνο ανέδειξε το NAD+ ως νέο παράγοντα για τη μείωση της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC, αλλά παρείχε και περαιτέρω στοιχεία που υποστηρίζουν την εγκυρότητα της τεχνολογίας μας για την πρόβλεψη της βλάβης του δέρματος που προκαλείται από την UVC. Δικαιολογείται να διερευνηθούν περαιτέρω οι μηχανισμοί που διέπουν την εγκυρότητα της τεχνολογίας.

Εικόνα 7. Η χορήγηση NAD+ εξασθένησε σημαντικά τις αυξήσεις στους λόγους Bcl-2/Bax του δέρματος των ποντικών που προκαλούνται από την UVC. A, B. Η UVC προκάλεσε σημαντικές μειώσεις στα επίπεδα της Bcl-2, οι οποίες αποτράπηκαν με την προθεραπεία με NAD+. A, C. Η UVC δεν επηρέασε σημαντικά τα επίπεδα της Bax, τα οποία δεν επηρεάστηκαν από την προχορήγηση NAD+. D. Η UVC προκάλεσε σημαντικές μειώσεις στους λόγους Bcl-2/Bax, οι οποίες αποτράπηκαν με τη χορήγηση NAD+. Αφού χορηγήθηκε στους ποντικούς 1 mg/kg NAD+, οι ποντικοί εκτέθηκαν σε ακτινοβολία UVC σε δόση 0,6 J/cm2. Μία ώρα μετά την ακτινοβολία, τα επίπεδα Bcl-2 και Bax του δέρματος προσδιορίστηκαν με αναλύσεις Western blot. N = 6· *, P < 0,05.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστούν για τη χρηματοδότηση από το Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant [7] No. 2017SHZDZX01) (προς W.Y.) και από το SJTUSTAR Medical-Engineering Interdisciplinary Youth Fund, που χρηματοδοτείται από το Shanghai Jiao Tong University (YG2019QNA36), προς Y.Z.

Δήλωση σύγκρουσης συμφερόντων

Καμία.

Αλληλογραφία: Dr. Weihai Ying, School of Biomedical Engineering and Med-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, P. R. China. E-mail: weihaiy@sjtu.edu.cn; Dr. Mingchao Zhang, Multiscale Research Institute of Complex Systems, Fudan University, Shanghai 200433, P. R. China. E-mail: 1058697003@qq.com

Βιβλιογραφία