Podawanie NAD+ wyraźnie zmniejsza uszkodzenia skóry wywołane promieniowaniem UVC, łagodząc stres oksydacyjny, stan zapalny, uszkodzenia DNA i apoptozę

-> Pobierz oryginalny artykuł tutaj

Mengmeng Li1, Mingchao Zhang1,2, Yin Zhang3, Yu Liang3, Weihai Ying1

1Med-X Research Institute and School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, P. R. China; 2Multiscale Research Institute of Complex Systems, Fudan University, Shanghai 200433, P. R. China; 3Department of Orthopedics, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 197 Ruijin 2nd Road, Shanghai 200025, P. R. China

Otrzymano 6 marca 2023; zaakceptowano 4 kwietnia 2023; Epub 15 kwietnia 2023; opublikowano 30 kwietnia 2023

Streszczenie: Promieniowanie ultrafioletowe (UV) jest główną przyczyną wielu poważnych chorób skóry, w tym raka skóry. Kluczowe jest odkrycie nowych substancji, które mogą wywierać silne działanie ochronne przed uszkodzeniami skóry wywołanymi przez UV. W niniejszym badaniu na modelu mysim określiliśmy wpływ NAD+ na uszkodzenia skóry wywołane przez UVC i zbadaliśmy mechanizmy leżące u podstaw tego działania, dokonując następujących odkryć: po pierwsze, wywołana przez UVC zielona autofluorescencja (AF) skóry była silnie skorelowana z rozległością uszkodzeń skóry wywołanych przez UVC; po drugie, podanie NAD+ silnie zmniejszyło uszkodzenia skóry wywołane przez UVC; po trzecie, podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC spadek poziomu mitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy; po czwarte, podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost poziomu cyklooksygenazy (COX) 2, markera stanu zapalnego; po piąte, podanie NAD+ silnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost uszkodzeń dwuniciowego DNA (dsDNA); po szóste, podanie NAD+ silnie osłabiło wywołany przez UVC spadek stosunku Bcl-2/Bax, wskaźnika apoptozy. Podsumowując, nasze badanie wykazało, że podanie NAD+ może silnie zmniejszać uszkodzenia skóry wywołane przez UVC poprzez osłabienie stresu oksydacyjnego, stanu zapalnego, uszkodzeń DNA i apoptozy, co wskazuje na duży potencjał NAD+ jako substancji chroniącej przed uszkodzeniami skóry wywołanymi przez UVC. Ponadto nasze badanie dodatkowo wskazało, że zielona AF skóry jest biomarkerem pozwalającym przewidywać uszkodzenia skóry wywołane przez UVC.

Słowa kluczowe: NAD+, UV, uszkodzenia skóry, apoptoza, zielona autofluorescencja

Wprowadzenie

NAD+ odgrywa kluczową rolę w wielu ważnych procesach biologicznych, w tym w metabolizmie energetycznym, funkcjonowaniu mitochondriów, śmierci komórek, naprawie DNA i funkcjach immunologicznych [1, 2]. Narastające dowody wskazują, że NAD+ może wywierać istotne korzystne działanie w wielu zwierzęcych modelach chorób, w tym w niedokrwiennym uszkodzeniu mózgu i niedokrwiennym uszkodzeniu mięśnia sercowego [3-5]. Zasadne jest dalsze określenie działania NAD+ w różnych modelach chorób oraz dalsze badanie mechanizmów leżących u podstaw wpływu NAD+ na uszkodzenia tkanek i narządów [3].

Promieniowanie UV jest kluczową przyczyną wielu chorób skóry, w tym raka skóry [6-8]. Promieniowanie UV może wywoływać liczne zmiany patologiczne w skórze, w tym fotostarzenie i raka skóry [8, 9], co wynika z jego zdolności do wywoływania w skórze zmian obejmujących stres oksydacyjny, stan zapalny, uszkodzenia DNA i apoptozę [10, 11]. Choć w wielu badaniach znaleziono substancje chroniące skórę [12, 13], niezwykle istotne jest odkrycie nowych substancji, które mogą zapewnić silną ochronę przed uszkodzeniami skóry wywołanymi przez UV.

Wyróżnia się trzy główne rodzaje promieniowania UV: UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) i UVC (100-280 nm) [8]. Z powodu stopniowego zubożenia warstwy ozonowej w atmosferze na powierzchnię Ziemi dociera coraz więcej promieniowania UVC, co staje się coraz ważniejszym problemem środowiskowym [14]. Ponieważ jest to promieniowanie jonizujące, UVC jest silnym mutagenem, który może powodować raka i choroby o podłożu immunologicznym [14]. Większość badań nad substancjami chroniącymi przed promieniowaniem UV koncentrowała się na substancjach chroniących przed uszkodzeniami skóry wywołanymi przez UVB lub UVA [12, 13]. Dlatego bardzo cenne jest poszukiwanie substancji, które mogą silnie zmniejszać uszkodzenia skóry wywołane przez UVC.

Istotne jest odkrycie biomarkerów umożliwiających nieinwazyjne przewidywanie uszkodzeń skóry wywołanych przez UV, co może znacząco zwiększyć nasze możliwości wczesnej diagnozy i interwencji w przypadku uszkodzeń skóry wywołanych przez UV [15]. Nasze niedawne badanie wskazało, że intensywność zielonej AF skóry jest biomarkerem pozwalającym przewidywać uszkodzenia skóry wywołane przez UVB/UVC [15]. Zasadne jest jednak uzyskanie dalszych dowodów, które potwierdzą i ugruntują to odkrycie, aby wprowadzić to nowatorskie podejście do wczesnej diagnozy i interwencji w przypadku uszkodzeń skóry wywołanych przez UV.

W obecnym badaniu skupiliśmy się na określeniu wpływu NAD+ na wywołane przez UVC uszkodzenia skóry u myszy i zbadaliśmy mechanizmy leżące u podstaw tego działania. Dodatkowo sprawdziliśmy trafność przewidywania uszkodzeń skóry wywołanych przez UVC na podstawie zielonej AF. Nasze badanie wykazało, że podanie NAD+ może silnie zmniejszać uszkodzenia skóry wywołane przez UVC poprzez osłabienie stresu oksydacyjnego, stanu zapalnego, uszkodzeń DNA i apoptozy. Nasze badanie dostarczyło również dalszych dowodów potwierdzających trafność metody opartej na zielonej AF w przewidywaniu uszkodzeń skóry wywołanych przez UVC.

Materiały i metody

Materiały

Formalinę, hematoksylinę, eozynę i NAD+ zakupiono w firmie Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Przeciwciała przeciwko SOD2 i aktynie uzyskano z firmy Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Przeciwciało przeciwko γ-H2AX zakupiono w firmie Abcam (Cambridge, UK). Przeciwciała przeciwko Bcl-2, Bax, katalazie i COX2 pozyskano z firmy Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Wszystkie pozostałe odczynniki miały najwyższą dostępną w handlu klasę czystości.

Przygotowanie roztworów NAD+

Nośnik przygotowano, mieszając równe objętości PBS i glicerolu. Roztwór podstawowy NAD+ o stężeniu końcowym 10 mg/ml przygotowano, dodając NAD+ do nośnika. NAD+ w dawce 1 mg/cm2 podawano na każde ucho.

Doświadczenia na zwierzętach

Samce myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni o masie 18-22 g (Lingchang Biotechnology Co., LTD., Shanghai) trzymano w obiekcie dla zwierząt SPF w kontrolowanej temperaturze i wilgotności. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Bioetyczną School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University. Po tygodniu obserwacji myszy naświetlano promieniowaniem UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2. Od 18 do 24 godz. po naświetleniu oznaczano zieloną AF uszu pod mikroskopem dwufotonowym (Nikon, Shanghai, China). Trzy dni po naświetleniu uszy pobrano i przechowywano w temperaturze -80°C.

Obrazowanie zielonej AF skóry: Obrazowanie zielonej AF skóry przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [15]. AF skóry uszu myszy obrazowano pod mikroskopem fluorescencyjnym (A1 plus, Nikon Instech Co., Ltd., Tokyo, Japan) w trybie jednofotonowym, przy długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 500-530 nm. AF oznaczano ilościowo w następujący sposób: na zeskanowanych obrazach losowo wybrano szesnaście punktów o wymiarach 100 μm × 100 μm. Obliczano średnią intensywność AF każdej warstwy, a następnie sumę średnich intensywności AF wszystkich warstw danego punktu, którą zdefiniowano jako intensywność AF tego punktu.

Badania histologiczne: Badania histologiczne przeprowadzono w sposób opisany wcześniej [15]. Pobrano bioptaty skóry z uszu myszy i natychmiast umieszczono je w buforze z 4% (w/v) paraformaldehydem. Po 12 do 24 godz. próbki zatopiono w parafinie. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta (C0105, Beyotime, Haimen, China).

Barwienie immunofluorescencyjne: Skrawki parafinowe przeniesiono, a następnie inkubowano z 0,2% Triton X-100 w PBS przez 10 min.

Rycina 1. UVC wywoływało zależne od dawki uszkodzenia skóry myszy. A, B. Naświetlanie UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2 powodowało zależne od dawki uszkodzenia skóry myszy. C. Dawki promieniowania były silnie skorelowane z nasileniem uszkodzeń skóry. Myszy poddano działaniu promieniowania UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2. Trzy dni po naświetleniu uszkodzenia skóry oceniano za pomocą barwienia H&E. N = 3. *, P < 0,05; **, P < 0,01. Podziałka = 100 μm.

Po przepłukaniu PBS skrawki blokowano 10% surowicą kozią przez 1 godz. w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałem anty-γ-H2AX (ab81299, Cell Signaling Technology, MA, USA) (rozcieńczenie 1:250) w PBS zawierającym 1% surowicy koziej. Po trzykrotnym przepłukaniu PBS skrawki inkubowano z przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor® 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) (rozcieńczenie 1:500, Molecular Probes, Eugene, Oregon, United States) w PBS zawierającym 1% surowicy koziej przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przepłukaniu PBS skrawki barwiono kontrastowo DAPI (rozcieńczenie 1:1000, Beyotime Institute of Biotechnology) w PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej. Obrazy fluorescencyjne wykonano pod mikroskopem konfokalnym Leica (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).

Western blotting

Skórę uszu myszy pobrano i poddano lizie w buforze RIPA (Millipore, Temecula, California, United States) zawierającym 1% mieszaniny inhibitorów proteaz, 1% mieszaniny inhibitorów fosfataz (CWBio, Beijing, China) i 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu. Lizaty wirowano przy 12000 obr./min przez 20 min w temperaturze 4°C. Po oznaczeniu ilościowym próbek białka za pomocą zestawu BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, United States) 30 μg białka całkowitego rozdzielono elektroforetycznie w 10% żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu, a następnie przeniesiono na membrany nitrocelulozowe 0,45 μm. Bloty inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałami pierwszorzędowymi w następujących rozcieńczeniach: przeciwciało anty-COX2 (Cat#12- 282, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (rozcieńczenie 1:1000), przeciwciało anty-SOD2 (sc-133134, Santa Cruz, California, United States) (rozcieńczenie 1:2000), przeciwciało anty-katalaza (Cat#14097, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (rozcieńczenie 1:2000), przeciwciało anty-Bcl-2 (Cat#3498, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (rozcieńczenie 1:2000), przeciwciało anty-Bax (Cat#5023, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) (rozcieńczenie 1:2000), przeciwciało anty-γ-H2AX (ab81299, Abcam, Cambridge, UK) (rozcieńczenie 1:4000) i przeciwciało anty-aktyna (sc-58673 Santa Cruz, California, United States) (rozcieńczenie 1:1000). Następnie bloty inkubowano z przeciwciałem HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (rozcieńczenie 1:4000) (Jackson ImmunoResearch, PA, USA) lub HRP conjugated Goat Anti-mouse IgG (rozcieńczenie 1:4000, HA1006, HuaBio, Zhejiang Province, China). Sygnały białek wykrywano za pomocą systemu detekcji ECL (Thermo Scientific, Pierce, IL, USA). Intensywność prążków oznaczano ilościowo metodą densytometrii za pomocą programu Image J.

Analiza statystyczna

Wyniki przedstawiono jako średnie ± błąd standardowy średniej (SEM). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji, a następnie testu post hoc Bonferroniego. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznawano za istotne statystycznie.

Rycina 2. UVC wywoływało zależny od dawki wzrost intensywności zielonej AF skóry myszy. A, B. Naświetlanie UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2 powodowało istotny i zależny od dawki wzrost zielonej AF skóry myszy. C. Dawki promieniowania były silnie skorelowane z poziomem intensywności zielonej AF. D. Stwierdzono silną korelację między poziomem intensywności zielonej AF a nasileniem uszkodzeń skóry. Myszy poddano działaniu promieniowania UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2. Od 18 do 24 godz. po naświetleniu zieloną AF skóry oznaczano pod mikroskopem konfokalnym. N = 9. *, P < 0,05; ***, P < 0,001. Podziałka = 20 μm.

Wyniki

Podanie NAD+ silnie zmniejszyło zarówno wywołane przez UVC uszkodzenia skóry, jak i wywołany przez UVC wzrost zielonej AF skóry myszy

Określiliśmy wpływ naświetlania UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2 na uszkodzenia skóry myszy: naświetlanie myszy UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2 spowodowało istotne uszkodzenia ich skóry (Rycina 1A). Analiza ilościowa uszkodzeń skóry wykazała, że UVC powodowało istotne i zależne od dawki uszkodzenia skóry (Rycina 1B). Ponadto dawki promieniowania były silnie skorelowane z nasileniem uszkodzeń skóry (Rycina 1C).

Określiliśmy również wpływ naświetlania UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2 na intensywność zielonej AF u myszy: naświetlanie UVC w dawkach 0; 0,3; 0,6 i 0,9 J/cm2 spowodowało wyraźny wzrost zielonej AF skóry myszy (Rycina 2A). Analiza ilościowa intensywności zielonej AF wykazała, że UVC powodowało istotny i zależny od dawki wzrost intensywności zielonej AF skóry (Rycina 2B). Dawki promieniowania były silnie skorelowane z poziomem intensywności zielonej AF (Rycina 2C). Ponadto stwierdzono silną korelację między poziomem intensywności zielonej AF a nasileniem uszkodzeń skóry (Rycina 2D).

Następnie określiliśmy wpływ podania NAD+ na wywołane przez UVC uszkodzenia skóry: podanie NAD+ wyraźnie zmniejszyło wywołane przez UVC uszkodzenia skóry (Rycina 3A). Analiza ilościowa danych wykazała, że podanie NAD+ istotnie zmniejszyło wywołane przez UVC uszkodzenia skóry (Rycina 3B). Podanie NAD+ również wyraźnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost intensywności zielonej AF skóry myszy (Rycina 3C). Analiza ilościowa danych wykazała, że podanie NAD+ istotnie zmniejszyło wywołany przez UVC wzrost intensywności zielonej AF skóry myszy (Rycina 3D).

Podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC spadek poziomu mitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej (SOD2) i katalazy, a także wywołany przez UVC wzrost poziomu COX2 w skórze myszy

Rycina 3. Podanie NAD+ silnie osłabiło zarówno wywołane przez UVC uszkodzenia skóry, jak i wywołany przez UVC wzrost zielonej AF skóry myszy. A, B. Podanie NAD+ istotnie zmniejszyło wywołane przez UVC uszkodzenia skóry. N = 3. ***, P < 0,001. Podziałka = 100 μm. C, D. Podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost intensywności zielonej AF skóry myszy. Po podaniu myszom NAD+ w dawce 1 mg/kg poddano je działaniu promieniowania UVC w dawce 0,6 J/cm2. Trzy dni po naświetleniu uszkodzenia skóry oceniano za pomocą barwienia H&E. Zieloną AF skóry oznaczano pod mikroskopem konfokalnym. N = 10. ***, P < 0,001. Podziałka = 20 μm.

Stwierdziliśmy, że UVC wywoływało istotny spadek aktywności SOD2 w skórze myszy, który został istotnie osłabiony przez podanie NAD+ (Rycina 4A i 4B). UVC wywoływało również istotny spadek poziomu katalazy w skórze myszy, który został istotnie osłabiony przez podanie NAD+ (Rycina 4C, 4D).

Stwierdziliśmy ponadto, że UVC wywoływało istotny wzrost poziomu COX2 (markera stanu zapalnego [16]) w skórze myszy (Rycina 5A, 5B). Podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost poziomu COX2 (Rycina 5A, 5B).

Podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost uszkodzeń dsDNA w skórze myszy

Nasze analizy metodą Western blot wykazały, że UVC wywoływało istotny wzrost poziomu fosforylowanego białka γ-H2AX, wskaźnika uszkodzeń dsDNA [17] (Rycina 6A, 6B). Podanie NAD+ zapobiegło wywołanemu przez UVC wzrostowi poziomu γ-H2AX (Rycina 6A, 6B). Nasze badania immunobarwienia również wykazały, że UVC wywoływało wyraźny wzrost poziomu białka γ-H2AX, któremu zapobiegało podanie NAD+ (Rycina 6C).

Następnie określiliśmy wpływ podania NAD+ na wywołane przez UVC sygnały apoptotyczne: UVC wywoływało istotny spadek poziomu Bcl-2, kluczowego białka antyapoptotycznego [18], któremu zapobiegało podanie NAD+ (Rycina 7A, 7B). Natomiast UVC nie wpływało istotnie na poziom Bax, ważnego białka proapoptotycznego [18], na który nie wpływało też podanie NAD+ (Rycina 7A, 7C). Podsumowując, UVC wywoływało istotny spadek stosunku Bcl-2/Bax, który został istotnie osłabiony przez podanie NAD+ (Rycina 7D).

Dyskusja

Do głównych wyników naszego badania należą: po pierwsze, wywołana przez UVC zielona AF skóry była silnie skorelowana z rozległością wywołanych przez UVC uszkodzeń skóry; po drugie, podanie NAD+ silnie zmniejszyło wywołane przez UVC uszkodzenia skóry; po trzecie, podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC spadek poziomu mitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w skórze; po czwarte, podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost poziomu COX2 w skórze; po piąte, podanie NAD+ silnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost uszkodzeń sDNA w skórze; po szóste, podanie NAD+ silnie osłabiło wywołany przez UVC spadek stosunku Bcl-2/Bax w skórze.

Rycina 4. Podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC spadek poziomu SOD2 i katalazy w skórze myszy. A, B. UVC wywoływało istotny spadek poziomu SOD2 w skórze myszy, który został istotnie osłabiony przez podanie NAD+. N = 16; *, P < 0,05. C, D. UVC wywoływało istotny spadek poziomu katalazy w skórze myszy, który został istotnie osłabiony przez podanie NAD+. Po podaniu myszom NAD+ w dawce 1 mg/kg poddano je działaniu promieniowania UVC w dawce 0,6 J/cm2. Godzinę po naświetleniu poziom SOD2 i katalazy w skórze oznaczano metodą Western blot. N = 6. *, P < 0,05.

Rycina 5. Podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost poziomu COX2 w skórze myszy. A, B. UVC wywoływało istotny wzrost poziomu COX2 w skórze myszy, który został istotnie osłabiony przez podanie NAD+. Po podaniu myszom NAD+ w dawce 1 mg/kg poddano je działaniu promieniowania UVC w dawce 0,6 J/cm2. Godzinę po naświetleniu poziom COX2 w skórze oznaczano metodą Western blot. N = 6; *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Promieniowanie UV jest głównym czynnikiem ryzyka wielu chorób skóry, w tym raka skóry [6-8]. Choć w wielu badaniach znaleziono substancje chroniące skórę, niezwykle istotne jest odkrycie nowych substancji, które mogą zapewnić ochronę przed uszkodzeniami skóry wywołanymi przez UV. Z powodu stopniowego zubożenia warstwy ozonowej w atmosferze na powierzchnię Ziemi dociera coraz więcej promieniowania UVC, co staje się coraz ważniejszym problemem środowiskowym [14]. Ponieważ jest to promieniowanie jonizujące, UVC jest silnym mutagenem, który może powodować raka i choroby o podłożu immunologicznym [14]. Dlatego bardzo cenne jest poszukiwanie substancji, które mogą silnie zmniejszać uszkodzenia skóry wywołane przez UVC. Nasze obecne badanie dostarczyło mocnych dowodów wskazujących, że NAD+ jest silnie działającą substancją, która może zmniejszać uszkodzenia skóry wywołane przez UVC. Ponadto nasze badanie wskazało mechanizmy leżące u podstaw ochronnego działania NAD+ przed uszkodzeniami skóry wywołanymi przez UVC: NAD+ może zmniejszać uszkodzenia skóry wywołane przez UVC, osłabiając wywołany przez UVC stres oksydacyjny, stan zapalny, uszkodzenia DNA i apoptozę.

Nasze badanie wskazało mechanizmy leżące u podstaw zapewnianej przez NAD+ ochrony przed uszkodzeniami skóry wywołanymi przez UVC: stwierdziliśmy, że podanie NAD+ może silnie osłabiać wywołany przez UVC spadek stosunku Bcl-2/Bax, wskaźnika sygnałów apoptotycznych, co sugeruje, że podanie NAD+ zmniejsza wywołane przez UVC uszkodzenia skóry co najmniej częściowo poprzez ograniczenie wywołanej przez UVC apoptozy w skórze. Ponieważ uszkodzenia dsDNA są ważnym induktorem apoptozy [19], nasze odkrycie, że podanie NAD+ może osłabiać wywołany przez UVC wzrost uszkodzeń dsDNA, sugeruje, że podanie NAD+ może zmniejszać wywołaną przez UVC apoptozę co najmniej częściowo poprzez osłabienie wywołanych przez UVC uszkodzeń dsDNA.

Rycina 6. Podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost poziomu γ-H2AX w skórze myszy. A, B. UVC wywoływało istotny wzrost poziomu białka γ-H2AX w skórze myszy, który został istotnie osłabiony przez podanie NAD+. C. Badania immunobarwienia wykazały, że UVC wywoływało wzrost poziomu białka γ-H2AX w skórze myszy, który został osłabiony przez podanie NAD+. Po podaniu myszom NAD+ w dawce 1 mg/kg poddano je działaniu promieniowania UVC w dawce 0,6 J/cm2. Godzinę po naświetleniu poziom γ-H2AX w skórze oznaczano metodą Western blot lub immunobarwienia. N = 7. *, P < 0,05. Podziałka = 20 μm.

Ponieważ UVC jest promieniowaniem jonizującym, może wywoływać nasilenie stresu oksydacyjnego w skórze [6-8], który jest ważnym czynnikiem patologicznym w uszkodzeniach skóry wywołanych przez UVC. Dlatego można było oczekiwać, że w naszym badaniu UVC spowoduje obniżenie aktywności katalazy i SOD2. Nasze badanie wykazało, że podanie NAD+ może istotnie osłabiać wywołany przez UVC spadek aktywności SOD2 i katalazy, co wskazuje, że NAD+ zmniejsza wywołane przez UVC uszkodzenia skóry co najmniej częściowo poprzez osłabienie stresu oksydacyjnego. Ponieważ stres oksydacyjny wywołuje uszkodzenia dsDNA [20] i apoptozę [21], nasze odkrycie sugeruje, że podanie NAD+ może osłabiać wywołany przez UVC wzrost uszkodzeń dsDNA i apoptozy co najmniej częściowo poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego. Stan zapalny jest kluczowym czynnikiem patologicznym w uszkodzeniach skóry wywołanych przez UV [22]. Nasze badanie wykazało, że podanie NAD+ może istotnie osłabiać wywołany przez UVC wzrost poziomu COX2, co sugeruje, że zmniejszenie wywołanego przez UVC stanu zapalnego może być kolejnym ważnym mechanizmem leżącym u podstaw korzystnego działania NAD+ na uszkodzenia skóry wywołane przez UVC.

Nasze badania wskazały, że zielona AF skóry jest nowym biomarkerem w diagnostyce wielu poważnych chorób, w tym ostrego udaru niedokrwiennego mózgu i raka płuca [23]. Nasze niedawne badanie wskazało również, że intensywność zielonej AF skóry jest biomarkerem pozwalającym przewidywać uszkodzenia skóry wywołane przez UVC [15]. Nasze obecne badanie dostarczyło dalszych dowodów potwierdzających to odkrycie: wywołana przez UVC zielona AF skóry była silnie skorelowana z wywołanymi przez UVC uszkodzeniami skóry. Dlatego ta nowatorska metoda ma duży potencjał w przyszłych zastosowaniach do przewidywania uszkodzeń skóry wywołanych przez UVC.

Podsumowując, nasze obecne badanie nie tylko wskazało NAD+ jako nową substancję zmniejszającą uszkodzenia skóry wywołane przez UVC, ale także dostarczyło dalszych dowodów potwierdzających trafność naszej technologii przewidywania uszkodzeń skóry wywołanych przez UVC. Zasadne jest dalsze badanie mechanizmów, na których opiera się trafność tej technologii.

Rycina 7. Podanie NAD+ istotnie osłabiło wywołany przez UVC wzrost stosunku Bcl-2/Bax w skórze myszy. A, B. UVC wywoływało istotny spadek poziomu Bcl-2, któremu zapobiegało wcześniejsze podanie NAD+. A, C. UVC nie wpływało istotnie na poziom Bax, na który nie wpływało też wcześniejsze podanie NAD+. D. UVC wywoływało istotny spadek stosunku Bcl-2/Bax, któremu zapobiegało podanie NAD+. Po podaniu myszom NAD+ w dawce 1 mg/kg poddano je działaniu promieniowania UVC w dawce 0,6 J/cm2. Godzinę po naświetleniu poziom Bcl-2 i Bax w skórze oznaczano metodą Western blot. N = 6; *, P < 0,05.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie w ramach Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (Grant [7] No. 2017SHZDZX01) (dla W.Y.) oraz SJTUSTAR Medical-Engineering Interdisciplinary Youth Fund finansowanego przez Shanghai Jiao Tong University (YG2019QNA36) dla Y.Z.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Brak.

Adres do korespondencji: Dr. Weihai Ying, School of Biomedical Engineering and Med-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, P. R. China. E-mail: weihaiy@sjtu.edu.cn; Dr. Mingchao Zhang, Multiscale Research Institute of Complex Systems, Fudan University, Shanghai 200433, P. R. China. E-mail: 1058697003@qq.com

Piśmiennictwo